PCR反(fan)應的(de)(de)(de)關鍵(jian)因素主要有引物的(de)(de)(de)選(xuan)擇與設計，酶的(de)(de)(de)質量(liang).模(mo)板(ban)(ban)(ban)的(de)(de)(de)制(zhi)備(bei)，在前二者都穩定可行的(de)(de)(de)情況下，PCR模(mo)板(ban)(ban)(ban)的(de)(de)(de)制(zhi)備(bei)尤(you)為重要。模(mo)板(ban)(ban)(ban)處理方法的(de)(de)(de)選(xuan)擇及(ji)操作人(ren)員的(de)(de)(de)基(ji) 本技能(neng)，決(jue)定分離模(mo)板(ban)(ban)(ban)核酸(DNA或RNA)的(de)(de)(de)質和量(liang)及(ji)PCR的(de)(de)(de)成敗.而提高(gao)模(mo)板(ban)(ban)(ban)核酸質量(liang)的(de)(de)(de) 關鍵(jian)是除去雜質(蛋(dan)白質、酶、脂肪等(deng))。除去抑制(zhi)Taq DNA聚合酶活(huo)性抑制(zhi)因子(zi)，提高(gao) 模(mo)板(ban)(ban)(ban)核酸的(de)(de)(de)產量(liang)。

傳統的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細胞組份，溶解細胞膜，使蛋白質變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質。

尤其是與DNA結合的蛋白質，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用。但近幾年來也發展了些 簡便實用較為有效的標本消化處理方法。亦可滿足PCR實驗的要求。采用哪種方法消化處理標本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環境條件而定。

模板核酸的提取制備方法

(一)蛋(dan)白酶(mei)K消化裂解法：

適用(yong)于所有標本的(de)消化處理，尤(you)以DNA樣品為(wei)佳(jia)。如組織(zhi)細胞(包(bao)(bao)括石蠟包(bao)(bao)埋組織(zhi))絨毛、毛發、精斑、血(xue)液(血(xue)清、血(xue)漿、全血(xue))局部(bu)分泌物、尿(niao)，糞便等。

1. 試劑配制

①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)

　　10mmol/LEDTA

　　150mmol/LNaCL

　　0.5%SDS

　　100～200ug/ml蛋(dan)白酶K

②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加(jia)入消(xiao)化液中。

2. 提取方法

有些標本、在(zai)用蛋(dan)白酶K消化前，還需預處(chu)理(li)一下(xia)，如(ru)糞便(bian)、分泌物(wu)、痰(tan)液、組織塊、石(shi)蠟包埋組織等(deng)，其方法有離(li)心去掉雜質，脫蠟等(deng)。

臨床標(biao)本或經預處(chu)理的(de)標(biao)本加蛋(dan)白(bai)酶K裂解液50～100ul。混勻，55℃1～3小時，或37℃過夜。加等(deng)體(ti)積的(de)飽和酚抽(chou)提1～2次，再加等(deng)體(ti)積的(de)氯仿(fang):異(yi)戊(wu)醇(chun)(49:1)抽(chou)提一 次，上(shang)清加入1/10體(ti)積的(de)pH值5.23mmol/L醋酸鈉(na)緩沖液，加入2.5倍(bei)體(ti)積的(de)冰冷無水 乙(yi)醇(chun)(或加等(deng)體(ti)積的(de)異(yi)丙醇(chun))-20℃放置至(zhi)少3h。

取出后(hou)14000轉/min離心15min.小心吸棄(qi)或(huo)倒出上清，沉(chen)淀加入(ru)75%冰冷乙(yi)醇15000r/min5min離心洗(xi)滌1～2次，特別小心的(de)吸棄(qi)或(huo)倒掉上清，真空或(huo)37℃溫箱或(huo)室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后(hou)，取3～8ul 用于(yu)PCR擴(kuo)增，或(huo)放-20℃保存。

蛋(dan)白酶(mei)K消(xiao)(xiao)化法除上述經(jing)(jing)典處理法外，亦(yi)可在(zai)蛋(dan)白K消(xiao)(xiao)化處理標(biao)本(ben)，經(jing)(jing)離(li)心處理后(hou)，吸取(qu)上清經(jing)(jing)95～97℃或(huo)煮沸10min滅(mie)活(huo)蛋(dan)白酶(mei)K后(hou)，直接作核酸模板(ban)用于PCR擴增。如(ru)雜質(zhi)較多，還可經(jing)(jing)酚:氯仿抽(chou)提后(hou)，即可用于PCR反應.此(ci)法蛋(dan)白質(zhi)及(ji)其它雜質(zhi)消(xiao)(xiao)除 徹底，Taq酶(mei)活(huo)性不受影響，具有良好的重復性與穩(wen)定(ding)性.但操作繁(fan)復，技術要求高。

(二)直接(jie)裂解(jie)法: 

標(biao)(biao)本(組織細胞，分泌物)加PBS或生(sheng)理(li)鹽水離(li)心(xin)洗滌后(hou)，加消(xiao)化裂(lie)解(jie)液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐(tu)溫-20)，95～98℃，15～30min以裂(lie)解(jie)病原體， 裂(lie)解(jie)細胞.然后(hou)12000r/min離(li)心(xin)5～10min，取(qu)上清(qing)(qing)20～30ul用于(yu)PCR擴增。血清(qing)(qing)標(biao)(biao)本可 直(zhi)加等體積(ji)的(de)消(xiao)化液，加熱處理(li)離(li)心(xin)后(hou)PCR擴增。亦(yi)有用5%的(de)NP-40和1.5%2-ME做裂(lie)解(jie)液，95℃30min消(xiao)化處理(li)，離(li)心(xin)取(qu)上清(qing)(qing)，PCR擴增檢測(ce)HBV DNA。

(三)堿變性法(fa): 

取血清(qing)20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，37℃30min，離(li)心，加 1mol/L HCl 20ul，離(li)心后，取上(shang)清(qing)5ul，用于PCR擴(kuo)增。*亦(yi)有用10ul血清(qing)加NaOH至(zhi) 0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和(he)離(li)心后取上(shang)清(qing)10ul做PCR，其特異(yi)性(xing)和(he)敏感性(xing)較前法更(geng)好。

(四)煮沸法:

經離心(xin)洗滌過(guo)的組織細胞(bao)，分泌物(wu)及血液標本，加適(shi)量無菌蒸餾水(shui)或PBS，混勻后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上(shang)清做PCR。

(五)碘(dian)化(hua)鈉法(fa): 

取(qu)組織細胞及抗(kang)凝(ning)血(xue)液(ye)10～100ul，加(jia)等體(ti)積(ji)的(de)6MNaI，反復輕混(hun)(hun) 20s，加(jia)等體(ti)積(ji)氯(lv)仿: 異戊醇(49:1)振勻后(hou)，離心取(qu)上清加(jia)0.6體(ti)積(ji)的(de)異丙醇，混(hun)(hun)勻后(hou) 置室溫3min。14000r/min 10min，沉淀加(jia)10～100ul，TE溶(rong)解，取(qu)5～10ul做PCR。

亦有用100ul血清加(jia)裂解液300ul(6M NaI，0.5%十(shi)二烷基肌酸鈉，10ug糖原(yuan)，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混勻(yun)后，60℃15min，加(jia)等體積異丙(bing)醇，離心沉淀后，加(jia)TE液用于PCR擴增，其產量(liang)和質(zhi)量(liang)較高。

(六)異硫氰酸胍法

此法主要(yao)用于RNA的提取(qu).標本(ben)為組織(zhi)細(xi)胞及血清等.

1.異(yi)硫氰酸胍消化液(ye)

異硫氰酸胍4mol/L

檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L

十二烷基肌酸鈉0.5%

β-巰基乙醇0.1mol/L

2.消化方法:

用(yong)50～100ul細(xi)胞(bao)懸液及(ji)血清，加(jia)等(deng)(deng)體(ti)積(ji)的異硫氰酸(suan)胍(gua)消化液振混(hun)勻 后，或(huo)65℃1小時，或(huo)室(shi)溫(wen)放(fang)置數分鐘，然后加(jia)1/10體(ti)積(ji)的3mmol/L pH5.2的醋(cu)酸(suan)鈉緩 沖液，再加(jia)等(deng)(deng)體(ti)積(ji)的酚(fen):氯仿，用(yong)力振搖約10s，10000r/min，離(li)心5min取(qu)上清。

加(jia)等體積異(yi)丙醇(chun)-20℃放置3h后，14000r/min離心15min，沉(chen)定用(yong)(yong)75%冰冷乙醇(chun)離心洗滌1～ 2次，真空干燥，沉(chen)淀用(yong)(yong)TE緩沖液溶解即(ji)可(ke)用(yong)(yong)于逆轉錄PCR擴(kuo)增，或放-20℃保存.

其(qi)它消(xiao)化(hua)處理標本提(ti)模(mo)板核酸的(de)方法(fa)(fa)(fa)有①異硫氰(qing)酸胍(gua)一二氧(yang)化(hua)硅(gui)法(fa)(fa)(fa)②異硫氰(qing)酸胍(gua) -玻璃(li)粉法(fa)(fa)(fa).③Chelex-100法(fa)(fa)(fa).④全血直(zhi)接(jie)擴(kuo)增法(fa)(fa)(fa)⑤尿素消(xiao)化(hua)裂解(jie)法(fa)(fa)(fa).各有千秋，可根據(ju) 情況選用。